LAS ALGAS MARINAS: EL AGAR - AGAR.- De la cocina a la Historia de la Microbiología

 

“El cultivo puro es la base de todas las investigaciones

 sobre enfermedades infecciosas”

 Robert Koch

El agar-agar se descubrió en 1658 en Japón de forma accidental, un posadero Minora Tarazaemon dejo la sopa de algas caliente en una noche muy fría y a la mañana siguiente descubrió que se había transformado en una masa sólida como una gelatina. En japonés se denominó “kanten” que significa el “cielo congelado”. Esta palabra hace referencia a la técnica de extracción artesanal de congelación y descongelación de este producto. La denominación de agar-agar viene del idioma malayo, que significa jalea y como es costumbre en las culturas de la polinesia se repite dos veces la palabra para darle más énfasis. También se denomina gelatina vegetal para distinguirla de la de procedencia animal. Desde entonces se extendió su uso por otros países asiáticos como producto culinario. Los mercaderes holandeses lo importaron a Europa, a mediados del siglo XIX, desde las costas asiáticas.

Este producto, el agar-agar, es un polisacárido complejo principalmente formado por galactosa que se acumula en las paredes de las células de las algas como fuente de energía. Se extrae de diferentes especies de algas rojas, generalmente de los géneros Gelidium, Gracilaria y Eucheuma , procedentes de todos los océanos, en España son frecuentes en el mar Cantábrico (Figura 1). Como agente solidificante el agar-agar es muy apreciado en la industria alimentaria, E-406, en helados, mermeladas, golosinas, postres, sopas, salsas y  para aclarar la cerveza; en la industria cosmética, en geles y como estabilizador; en preparados farmacéuticos, como laxante. Este compuesto no tiene sabor, absorbe gran cantidad de agua, no se digiere, posee gran poder de saciedad y no aporta poder calórico, por esto se utiliza en las dietas de adelgazamiento. 

La introducción del agar-agar en el laboratorio de Bacteriología, como se denominaba entonces, fue a finales del siglo XIX y supuso un gran avance para el descubrimiento de las bacterias patógenas como voy a describir a continuación. 

Los microorganismos existen desde hace más de 4000 millones de años, sin embargo hasta 1675 no fueron descubiertos. Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) era un rico comerciante holandés de telas y un gran experto en pulir lentes en sus ratos de ocio, además el uso de las lentes le era familiar ya que se utilizaban para comprobar la calidad de los tejidos (Figura 2). En sus observaciones con un microscopio simple, que había construido montando una lente esférica sobre placas de oro, plata o cobre, descubrió los microorganismos en una muestra de agua de su estanque, en la cual observó muchas criaturas pequeñas que pululaban, a las que denominó “animálculos”. Esta era la primera descripción de los microorganismos y sus dibujos han pasado a la Historia de la Microbiología gracias a su interés por comunicarlos a través de sus numerosas cartas, más de 300, a una sociedad científica de la época, la Royal Society de Londres. 

El dibujo de los microorganismos en apariencia parece muy simple, pero encierra tres enseñanzas muy importantes: que los microorganismos tienen diferentes formas y tamaños (A, B, F y G), que algunos poseen movimiento (C – D) y que otros se agrupan en paquetes cúbicos (H) que se denominan sarcinas (Figura 3). En un principio los científicos ingleses no prestaron un gran interés a los relatos de sus observaciones, por venir de un hombre que no era culto y que no sabía la lengua de la Ciencia, que era el latín. Por otra parte esto fue una ventaja, ya que no estaba rodeado del misterio y secretismo que envolvía a los sabios de la época. En su comercio le gustaba mostrar varios microscopios con preparaciones para observar las muestras más diversas. Fue la primera persona que observó los espermatozoides de su propio semen, así como los glóbulos rojos y los microbios de la cavidad oral. Las anécdotas de la Historia de la Microbiología cuentan que un día fueron a su comercio unas señoras de la alta sociedad de Delft y les mostró al microscopio una muestra de su sarro dental, ante aquella visión de los “animálculos” quedaron horrorizadas y se fueron despavoridas.   

El nacimiento de la Microbiología como Ciencia tardaría todavía en aparecer casi 200 años después y estuvo ligado a las grandes controversias que hubo hasta las últimas décadas del siglo XIX. También fue necesario para el avance de esta Ciencia desarrollar estrategias experimentales de laboratorio como la esterilización, el cultivo puro y las técnicas microscópicas, así como el perfeccionamiento del microscopio compuesto que tenía muchas aberraciones ópticas. En esa época, denominada la “Edad de Oro” de la Microbiología, surgen dos grandes maestros en esta incipiente Ciencia, los profesores Louis Pasteur (1822-1895) y Robert Koch (1843- 1910), gracias a sus trabajos comenzó a ser considerada como una disciplina experimental y la Historia los ha reconocido como los padres de la Microbiología. Su formación académica y su carácter hizo que estos dos sabios se dedicaran a temáticas diferentes, Pasteur a combatir la teoría de la generación espontanea, estudiar el origen microbiano de las fermentaciones y luchar contra las enfermedades infecciosas con el desarrollo de vacunas. Koch tenía una gran curiosidad científica, mucha constancia y tenacidad, además de un gran amor por la medicina. Todo esto le hizo dirigir su interés al mundo de los microorganismos y su relación con las enfermedades infecciosas. Su trabajo se centró en buscar en el laboratorio métodos sencillos para aislar los microorganismos infecciosos en cultivo puro y mejorar las técnicas de tinción para su observación microscópica, todo esto era  indispensable para poder estudiarlos.

Robert Koch (Figura 4) era un médico rural alemán que ejercía en el distrito de Wollstein en la Prusia Polaca y que se propuso estudiar un problema sanitario y económico que afectaba a la población de su entorno y para ello montó en su propia casa un laboratorio y un cuarto para pequeños animales de experimentación. Estos primeros estudios se centraron en el ántrax o carbunco ya que en aquella época fue testigo de una epidemia que arrasaba a cientos de cabezas de ganado. El carbunco es una zoonosis que puede afectar a los animales y también al hombre a través de distintas vías de infección. Los animales herbívoros como el ganado bovino, ovino y caprino contraen el carbunco a través de los pastos contaminados con esporas procedentes de los cadáveres de animales enfermos, los ganaderos llamaban a estas zonas los “campos malditos”. En el hombre la forma más frecuente de la enfermedad es el carbunco cutáneo, que se contrae a través de heridas en la piel,  enfermedad profesional en personas que manejan animales enfermos o productos de ellos. Por el aspecto de las lesiones se le ha llamado la “pústula maligna”. Otra manifestación es el carbunco respiratorio, que es la más grave y se contrae por inhalación de las esporas. Se ha denominado enfermedad de los “cardadores de lana” y era frecuente en otros tiempos entre las personas que manejaban grandes cantidades de lana o de pieles. La forma más rara es el carbunco gastrointestinal que se contrae por comer carne cruda de animales enfermos y sucede generalmente en sociedades muy primitivas.

El ántrax  fue en la década de 1871-1881 el protagonista de los descubrimientos biológicos. Cuando Koch cumplió 29 años su esposa, Emmy Fraatz (1847-1913), le regaló un microscopio de la marca Carl Zeiss con el que observó una gota de sangre de un animal afectado por el ántrax. En la preparación vio glóbulos rojos y blancos y una especie de “bastoncillos” formando largas cadenas que los denomino bacilos. Esta visión le sugirió la idea de que ese ser microscópico podría producir la enfermedad. Inmediatamente se puso a cultivar la sangre de los animales enfermos en un caldo de carne  y a base de hacer diluciones logro un cultivo puro del microorganismo. Este método era muy largo y tedioso y tenía que encontrar otra técnica para aislar en cultivo puro el microorganismo causante de la enfermedad, que generalmente no está solo en la muestra patológica. Se le ocurrió  hacer los cultivos sobre rodajas de patata, que previamente había esterilizado. Sobre su superficie haciendo estrías con un hilo de platino extendió la muestra y después de la incubación aparecieron unas colonias macroscópicas, con unas características determinadas, que suponía estaban formadas por millones de seres que se habían formado por la multiplicación exponencial de un solo individuo. Otra técnica que utilizó para lograr los cultivos puros fue añadir gelatina a un caldo de carne y dejarlo solidificar sobre unas láminas o placas de cristal para después sembrar la muestra por estría en superficie. Estas placas las introducía luego en un aparato con una campana de cristal para evitar la contaminación del aire (Figura 5). Con todas estas técnicas y los ensayos en ratones logro descubrir en 1877 la primera bacteria patógena Bacillus anthracis  y demostrar que era la causante del ántrax o carbunco. 

Todos estos trabajos le llevaron a Koch a otro descubrimiento muy importante, que el bacilo del carbunco era capaz de producir unas formas de resistencia denominadas esporas. Cada célula microbiana producía una espora y su resistencia a los agentes antimicrobianos físicos y químicos era mucho mayor que la de las células vegetativas, por lo cual tuvieron que modificar y adaptar las técnicas de esterilización en el laboratorio. Las esporas se forman cuando las condiciones ambientales no son favorables para el crecimiento y multiplicación de las células vegetativas y pueden permanecer en el suelo durante largos periodos de tiempo hasta su germinación, para volver a formar las células vegetativas cuando las condiciones sean favorables. Koch con todos estos datos encontró la causa por la cual enfermaban tantos animales. La sangre y los restos de los cadáveres de los animales muertos por carbunco se desparramaban por el suelo y los bacilos se transformaban en esporas. Con los pastos los animales ingerían las esporas del suelo causando brotes esporádicos. Una vez  en el intestino las esporas germinaban y volvían a formarse los bacilos que producían la enfermedad, volviéndose a cerrar el ciclo. 

Las esporas de carbunco han sido protagonistas en este siglo XXI de una nueva forma de contraer la enfermedad por inoculación de droga contaminada, como sucedió con la heroína. Bacillus anthracis es un microorganismo fácil de manejar en el laboratorio y barato de cultivar en grandes cantidades, para luego formar las esporas. Por sus características está incluido en la lista de los agentes biológicos que tienen “potencial para ser una severa amenaza a la salud y seguridad pública ” y es uno de los agentes que se puede utilizar con más probabilidad en casos de Bioterrorismo. Las esporas se han utilizado en guerras y más recientemente, en 2001, a través de envíos postales, mezcladas con harina, a políticos y periodistas en los Estados Unidos de América. 

Los descubrimientos de Koch hicieron que pasara, en 1881, de ser un desconocido médico rural a dirigir el Instituto de Salud Imperial en Berlín. El laboratorio que Koch tenía en su casa era muy sencillo y no tenía equipamiento y por supuesto medidas de seguridad para el tipo de experimentos que realizaba. La imperial Alemania del II Reich era una potencia política y militar fuerte y decidió apoyar sus investigaciones por la enorme importancia social y económica que tenían. En este nuevo laboratorio se rodeo de unos ayudantes entusiasmados por esta nueva Ciencia, que siguiendo la estela del maestro han pasado a la Historia de la Microbiología por sus descubrimientos. El profesor solía decir “que una vez hallados los métodos, los descubrimientos me cayeron en el regazo como fruta madura ”. Entre sus discípulos  voy a citar solo a dos Walter Hesse (1846-1911) y Julius Richard Petri (1852-1921). Sus aportaciones técnicas que voy a describir a continuación, todavía están vigentes, en este momento, en los laboratorios de Microbiología y conservan su lugar y utilidad en el diagnóstico clínico de enfermedades producidas por bacterias y hongos, en una época  donde se han desarrollado técnicas genéticas muy usadas, como la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). 

Otra enfermedad que preocupaba en esa época era la tuberculosis y todos los esfuerzos de Koch y parte de su equipo se centraron en descubrir el agente productor de esta enfermedad. Para poderlo estudiar era necesario aislar el germen, como se decía entonces, en cultivo puro en el laboratorio y luego ensayar su poder patógeno en animales, ratones y cobayas. Los medios de cultivo de caldo de carne con gelatina tenían el problema de que esta sustancia tiene un punto de fusión muy bajo (35º C) y las estufas para el cultivo de estas bacterias están a una temperatura de 37 a 38ºC y algunas veces más altas.  Además algunos microorganismos hidrolizan la gelatina “se comen la gelatina” y al cabo de unas horas en la estufa el medio de cultivo se convierte en un líquido turbio que hacía imposible el aislamiento. Un ayudante del laboratorio, Hesse, al llegar a su casa comento este problema técnico a su esposa Fanny y ella le dio un consejo práctico con el cual se resolvió esta cuestión, usar agar-agar para solidificar los medios de cultivo. Por esa importante aportación este matrimonio ha pasado a la Historia de la Microbiología (Figura 6).

Walter Hesse era médico en barcos de pasajeros y conoció a su esposa Fanny Eilshemius (1850-1934) en Nueva York, posteriormente ya casado se estableció en Alemania, como médico rural en una zona minera, Zittau (Sajonia), donde inició el estudio de las enfermedades de los mineros para mejorar sus condiciones de higiene pública y ambiental. Su interés por la Microbiología surgió por esta preocupación por los temas ambientales. En 1881 dejo su puesto de médico rural para ir a trabajar al laboratorio de Koch, en Berlín, en estudios de contaminación del aire, agua potable y aguas residuales. Fanny apoyaba a su esposo en sus proyectos y como era una gran dibujante y pintora hacia las ilustraciones para sus publicaciones de las colonias de bacterias y observaciones microscópicas. Walter aislaba las bacterias del aire utilizando como medios de cultivo las rodajas de patata y el caldo de carne con gelatina. Algunas bacterias son muy exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales y no crecen en un sustrato pobre como la patata y los medios con gelatina tenían la dificultad que hemos comentado anteriormente. Fanny comprendió que la solución a los problemas de su esposo estaba en su cocina. Cuando ella era pequeña y vivía en Nueva  York con su familia, tenía unos vecinos holandeses que habían vivido en la isla de Java y a través de ellos conocieron el agar-agar, una gelatina vegetal de origen marino, que se utilizaba en lugares de clima cálido para solidificar jaleas y espesar caldos. Fanny había utilizado este producto durante años para sus mermeladas y postres. Hesse comunicó esta idea de su esposa inmediatamente al profesor Koch y comenzaron a utilizarlo en el laboratorio para solidificar los caldos de carne y poder estudiar el origen de la tuberculosis. Gracias a la gran cantidad de nutrientes del caldo las bacterias crecían bien y como forma un gel translúcido permitía la observación macroscópica de las colonias y sus características diferenciales.

Koch expuso estos métodos de cultivo en un Congreso Internacional de Medicina en Londres en agosto de 1881 y con ellos pudo aislar en cultivo puro y estudiar el agente productor de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. En una publicación de 1882, titulada: “Die Ätiologie der Tuberkulose”, se describió por primera vez el uso del agar-agar en Microbiología. Esta bacteria fue descubierta ese mismo año y el 24 de marzo de 1882 expuso públicamente sus resultados en la Sociedad Fisiológica de Berlín en una ponencia con este título: “Über Tuberculose”. Esta bacteria es conocida generalmente con el epónimo de bacilo de Koch en honor de su descubridor y desde esa fecha se celebra el 24 de marzo el Día Mundial de la Tuberculosis. Todos los hallazgos encontrados por Koch fueron expuestos en 1890 en el X Congreso Internacional de Medicina en Berlín  y en 1901 en el Congreso Internacional de Tuberculosis en Londres (Figura 7). 

Un avance importante en esos años para el aislamiento y cultivo de los microorganismos fue idea de otro ayudante del laboratorio de Koch, Julius Richard  Petri. Con el objeto de mejorar las técnicas de cultivo se le ocurrió diseñar unas cajitas de cristal redondas de unos 22 centimetros de diámetro para solidificar dentro de ellas los medios de cultivo que contenían agar-agar. Con ello terminó con la utilización de las engorrosas láminas de cristal cubiertas con campanas del mismo material que se utilizaban esta entonces. En 1887, Petri publicó un artículo donde describía esta pequeña modificación a la técnica de cultivo usada por Koch, titulado: “Eine kleine Modifikation der Koch´schen Plattenverfahrens” (Figura 8). 

Las cajas o placas de Petri como se denominan hasta la actualidad son utilizadas a diario en los laboratorios de Microbiología para el estudio de los microorganismos. Ahora que estamos en la época del plástico las placas son exactamente iguales que las primeras, pero de este material desechable (Figuras 9 y 10).  

El agar-agar se sigue utilizando desde 1881,  todavía en el laboratorio de Microbiología para el cultivo de bacterias, hongos y virus, que infectan a las bacterias, denominados bacteriófagos, que significa que “comen bacterias”. Las múltiples aplicaciones que tiene se deben a sus propiedades, algunas de gran importancia, como su gran histéresis térmica por el amplio rango entre el punto de solidificación (32 a 45ºC) y de fusión (85 a 95ºC), con lo cual se resolvió el problema de la utilización de la gelatina de origen animal para solidificar los medios de cultivo. Además forma un gel duro y transparente, muy pocos microorganismos degradan este compuesto y todo esto le hace muy útil en las investigaciones clínicas, aplicadas o básicas que se llevan a cabo en un laboratorio del siglo XXI.

En estos tiempos que estamos viviendo la Microbiología vuelve a ser la protagonista que marca el ritmo de nuestras vidas, por un virus que por su gran poder infectivo se ha extendido por todo el mundo. Confiemos en los científicos actuales que, como en una carrera de relevos, portan la antorcha de la Ciencia como continuadores de los viejos maestros que desde finales del siglo XIX los han precedido en el progreso de la Microbiología, para beneficio de la Humanidad y hagan que salgamos lo más pronto posible de esta pandemia.

Autora: María Ángeles Mosso Romeo

Profesora Departamento de Microbiología II

Facultad de Farmacia

Universidad Complutense de Madrid